Ziehl-Neelsen stain: รากฐานน้ำยาและเทคนิค

Ziehl-Neelsen การย้อมสี ด้วยเทคนิคการ ย้อมสี เพื่อระบุจุลินทรีย์ที่ทนแอลกอฮอล์ - กรด (AAR) ชื่อของกระบวนการทางจุลชีววิทยานี้อ้างถึงผู้แต่ง: นักแบคทีเรียวิทยา Franz Ziehl และนักพยาธิวิทยา Friedrich Neelsen

เทคนิคนี้เป็นประเภทของการย้อมสีที่แตกต่างกันซึ่งแสดงถึงการใช้สีย้อมต่าง ๆ เพื่อสร้างความแตกต่างระหว่างโครงสร้างที่คุณต้องการที่จะสังเกตเห็นความแตกต่างและการระบุในภายหลัง คราบ Ziehl-Neelsen ทำหน้าที่ในการระบุจุลินทรีย์บางประเภท

เชื้อจุลินทรีย์เหล่านี้บางชนิดเป็นเชื้อมัยโคแบคทีเรีย (ตัวอย่างเช่น เชื้อมัยโคแบคทีเรียม ), โนคาร์เดีย (เช่น Nocardia sp.) และปรสิตเซลล์เดียว (เช่น Cryptosporidium parvum ) แบคทีเรียจำนวนมากสามารถจำแนกได้โดยใช้เทคนิคทั่วไปที่เรียกว่า Gram stain

อย่างไรก็ตามกลุ่มแบคทีเรียบางกลุ่มต้องการวิธีการอื่นเพื่อระบุ เทคนิคเช่นการย้อมสี Ziehl-Neelsen จำเป็นต้องใช้สีย้อมผสมกับความร้อนเพื่อยึดติดกับผนังเซลล์ก่อน

จากนั้นกระบวนการเปลี่ยนสีที่ช่วยให้ผลลัพธ์ที่สอง: ความต้านทานหรือความไวต่อการเปลี่ยนสีโดยกรดและแอลกอฮอล์

มูลนิธิ

พื้นฐานของเทคนิคการย้อมสีนี้ขึ้นอยู่กับคุณสมบัติของผนังเซลล์ของจุลินทรีย์เหล่านี้ ผนังเกิดจากกรดไขมันชนิดหนึ่งที่เรียกว่ากรด mycolic เหล่านี้มีลักษณะโซ่ยาวมาก

เมื่อกรดไขมันมีโครงสร้างที่ยาวมากพวกเขาสามารถเก็บสีย้อมได้ง่ายขึ้น แบคทีเรียบางชนิดนั้นยากต่อการย้อมด้วย Gram stain เนื่องจากปริมาณกรด mycolic สูงของผนังเซลล์

ในคราบ Ziehl-Neelsen จะใช้สีฟีนอลิกคาร์โบลฟูชซินซึ่งเป็นสีย้อมพื้นฐาน สิ่งนี้มีความสามารถในการโต้ตอบกับกรดไขมันในผนังเซลล์ซึ่งเป็นข้าวเหนียวในพื้นผิวที่อุณหภูมิห้อง

Carbol fuchsin stain ได้รับการปรับปรุงให้ดีขึ้นในที่ที่มีความร้อนเนื่องจากขี้ผึ้งละลายและโมเลกุลของสีย้อมจะเคลื่อนที่อย่างรวดเร็วยิ่งขึ้นไปที่ผนังเซลล์

กรดที่ใช้ในภายหลังจะทำหน้าที่เปลี่ยนสีเซลล์ที่ไม่ได้เปื้อนเพราะผนังของพวกมันไม่เกี่ยวข้องกับสีที่เพียงพอ ดังนั้นความแข็งแรงของตัวลดกรดจึงสามารถกำจัดสีย้อมกรดได้ เซลล์ที่ต่อต้านการเปลี่ยนสีนี้เรียกว่าทนกรด

สีรอง

หลังจากการเปลี่ยนสีของตัวอย่างนี้จะเปรียบเทียบกับสีย้อมอื่นที่เรียกว่าสีรอง มักใช้เมทิลีนสีน้ำเงินหรือมรกตสีเขียว

สีย้อมทุติยภูมิวัสดุพื้นหลังและทำให้เกิดความแตกต่างกับโครงสร้างที่ย้อมในขั้นตอนแรก เฉพาะเซลล์ฟอกขาวเท่านั้นที่จะดูดซับสีย้อมที่สอง (ป้องกันการย้อมสี) และใช้สีของพวกเขาในขณะที่เซลล์ที่เป็นกรดอย่างรวดเร็วจะคงสีแดงไว้

ขั้นตอนนี้มักใช้เพื่อระบุ เชื้อ Mycobacterium tuberculosis และ Mycobacterium leprae ซึ่งเรียกว่า acid-fast bacilli

น้ำยา

ระบายสีเบื้องต้น

ใช้ Carboxin 0.3% fuchsin (กรองแล้ว) สีย้อมนี้เตรียมจากส่วนผสมของแอลกอฮอล์: ฟีนอลในเอทานอล (90%) หรือเมทานอล (95%) และในส่วนผสมนี้ฟิวซินพื้นฐาน 3 กรัมจะถูกละลาย

แก้ปัญหาการลดสี

ในขั้นตอนนี้สามารถใช้สารละลายแอลกอฮอล์ 3% กรดหรือกรดซัลฟิวริก 25%

สีรอง (ต่อต้านสี)

สีย้อมที่ใช้กันมากที่สุดในการแสดงความคมชัดในตัวอย่างมักจะเป็นเมทิลีนสีน้ำเงิน 0.3% อย่างไรก็ตามคนอื่น ๆ ยังสามารถใช้เช่นสีเขียวมรกต 0.5%

เทคนิค

ขั้นตอนการย้อมสีด้วยกรดอย่างรวดเร็ว

เตรียมรอยเปื้อนแบคทีเรีย

การเตรียมการนี้ทำบนสไลด์ที่สะอาดและแห้งโดยปฏิบัติตามข้อควรระวังในการปลอดเชื้อ

ทำให้รอยเปื้อนแห้ง

ปล่อยให้รอยเปื้อนให้แห้งที่อุณหภูมิห้อง

ความร้อนตัวอย่าง

ตัวอย่างจะต้องได้รับความร้อนโดยการใช้ไฟบนสไลด์ด้านล่าง การแก้ไขด้วยแอลกอฮอล์สามารถทำได้เมื่อ smear ไม่ได้ถูกจัดทำด้วยเสมหะ (รักษาด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์เพื่อขาว) และถ้ามันจะไม่เปื้อนทันที

M. tuberculosis ถูกกำจัดด้วยสารฟอกขาวและในระหว่างกระบวนการย้อมสี เสมหะที่ไม่ผ่านการบำบัดจะไม่ฆ่า เชื้อวัณโรค ในขณะที่การตรึงด้วยแอลกอฮอล์จะทำให้เกิดแบคทีเรีย

ครอบคลุมคราบ

คราบถูกปกคลุมไปด้วยวิธีแก้ปัญหา carbol fuchsin (คราบพื้นฐานหลัก)

ความร้อนรอยเปื้อน

เสร็จประมาณ 5 นาที คุณควรสังเกตการปล่อยไอ (ประมาณ 60 ° C) มันเป็นสิ่งสำคัญที่จะไม่ทำให้ร้อนมากเกินไปและหลีกเลี่ยงการเผาตัวอย่าง

สำหรับความร้อนของคราบจะต้องระมัดระวังเป็นพิเศษเมื่อทำความร้อน carbol fuchsin โดยเฉพาะอย่างยิ่งถ้าทำการย้อมสีบนถาดหรือภาชนะอื่น ๆ ที่เก็บสารเคมีที่ติดไฟได้สูงจากคราบก่อนหน้านี้

ควรใช้เปลวไฟเล็ก ๆ ใต้สไลด์โดยใช้หลอดไฟที่ชุบด้วยแอลกอฮอล์แอลกอฮอลล์เมทานอลหรือ 70% หลีกเลี่ยงการใช้ไม้กวาดขนาดใหญ่ที่แช่ในเอทานอลเนื่องจากเป็นอันตรายจากไฟไหม้

ล้างคราบ

ควรล้างด้วยน้ำสะอาด หากน้ำประปาไม่สะอาดให้ล้างป้ายด้วยน้ำที่ผ่านการกรองหรือกลั่นแล้วโดยเฉพาะอย่างยิ่ง

ปกคลุมรอยเปื้อนด้วยแอลกอฮอล์กรด

แอลกอฮอล์กรดนี้ควรอยู่ที่ 3% ความคุ้มครองจะดำเนินการเป็นเวลา 5 นาทีหรือจนกว่ารอยเปื้อนจะเปลี่ยนสีเพียงพอนั่นคือสีชมพูอ่อน

จะต้องคำนึงถึงว่าแอลกอฮอล์ที่เป็นกรดนั้นติดไฟได้ ดังนั้นจึงต้องใช้อย่างระมัดระวัง หลีกเลี่ยงการอยู่ใกล้แหล่งกำเนิดประกายไฟ

ล้างคราบ

ควรซักด้วยน้ำสะอาดและน้ำกลั่น

ปิดบังรอยเปื้อนด้วยสีย้อม

มันอาจเป็นสีเขียวมรกต (0.5%) หรือสีย้อมเมทิลีนสีน้ำเงิน (0.3%) เป็นเวลา 1 หรือ 2 นาทีโดยใช้เวลานานที่สุดหากรอยเปื้อนบาง

ล้างคราบ

ต้องใช้น้ำสะอาดอีกครั้ง (กลั่น)

ท่อระบายน้ำ

ควรทำความสะอาดด้านหลังของสไลด์และวางคราบบนหิ้งระบายน้ำเพื่อให้อากาศแห้ง (ห้ามใช้กระดาษดูดซับสำหรับทำแห้ง)

ตรวจสอบรอยเปื้อนในกล้องจุลทรรศน์

ควรใช้วัตถุประสงค์ 100X และน้ำมันแช่ สแกนป้ายอย่างเป็นระบบและจดบันทึกข้อสังเกตที่เกี่ยวข้อง

ตีความผลลัพธ์

ในทางทฤษฎีจุลินทรีย์ที่ย้อมด้วยสีแดงถือว่าเป็นผลบวกที่เป็นกรด (AAR +)

ในทางตรงกันข้ามถ้าจุลินทรีย์มีสีย้อมสีน้ำเงินหรือสีเขียวขึ้นอยู่กับสีย้อมที่ใช้เป็นสีย้อมเคาน์เตอร์พวกเขาจะถือว่ากรดลบแอลกอฮอล์ทนลบ (AAR-)